上一期类器官干货中，小恒为大家介绍了肝胆类器官及其建立方法。从命名上不难看出正规股票配资门户，肝和胆是既相互独立又相互依赖的两个器官。在类器官研究领域，有肝细胞类器官、肝胆类器官，也有胆管细胞类器官，前两类已在往期内容中为大家讲解，胆管细胞类器官我们将分两期内容给大家系统介绍。
1. 胆道系统
胆道系统是一个复杂的管状网络，负责将肝脏产生的胆汁输送至十二指肠，以参与脂肪的消化与吸收。该系统在解剖结构上主要分为三部分：肝内胆管（IHBD）、肝外胆管（EHBD）和胆囊。IHBD位于肝脏内部，以其独特的分支状结构为特征；EHBD则包括肝总管和胆总管；胆囊是一个位于肝脏下方的囊状器官，用于储存和浓缩胆汁。
图1. 胆道系统[1]
排列在整个胆道系统内壁的上皮细胞称为胆管细胞，它们既为胆汁运输提供物理屏障，又能通过吸收和分泌功能主动调节胆汁的成分，还具有免疫和损伤修复的作用。值得注意的是，胆管细胞具有异质性，其起源和功能因在胆道树中的位置而异。其中IHBD细胞由肝母细胞分化而来，依赖SOX4和SOX9等转录因子；而EHBD细胞则源自内胚层，表达PDX1、PROX1和SOX17等另一组转录因子[2]。当分化成熟后，它们会表达KRT7、KRT19、CFTR等一系列关键的胆道功能标志物[2]。在正常情况下，胆管细胞处于静止状态。一旦发生损伤，它们会被激活并启动增殖以进行修复。根据损伤类型不同，胆管细胞的增殖主要有两种方式：一是“典型”增殖，即由原有胆管细胞增殖形成新的IHBD；二是“非典型”增殖，常见于慢性肝损伤中，肝细胞可以直接转分化为胆管细胞。此外，位于胆管细小分支和胆管周围腺体中的肝祖细胞和胆管树祖细胞在再生过程中至关重要，它们能够增殖并分化为新的胆管细胞来修复损伤[1]。
展开剩余89%图2. 胆道损伤后再生[1]
2. 胆管细胞类器官
为深入研究胆道疾病并开发再生医学疗法，科学家们利用不同来源的细胞成功建立出多种胆管细胞类器官。这些类器官包括来源于IHBD的肝内胆管细胞类器官（intrahepatic cholangiocyte organoids，ICO）和分支胆管细胞类器官（branching cholangiocyte organoid，BRCO）、来源于胆总管的肝外胆管细胞类器官（extrahepatic cholangiocyte organoids，ECO）、来源于胆汁的胆管细胞类器官（bile-derived organoids，BCO），以及来源于胆囊的胆囊胆管细胞类器官（gallbladder cholangiocyte organoids，GCO）。下面我们将介绍ICO和BRCO的建立方法。
2.1 肝内胆管细胞类器官（ICO）
图3. 胆管细胞类器官的来源和生成[1]
2.1.1 IHBD来源的ICO建立过程[3]
（1）组织来源：成人肝组织活检样本。
（2）组织处理与消化：将肝组织切成0.5–1 cm3的小块，使用Earle's平衡盐溶液清洗两次。接着在37℃下，用含有胶原酶Type A的Adv DMEM/F-12培养基消化15 min。随后加入冷的 advanced DMEM/F-12 终止反应。
（3）细胞分离与过滤：将细胞通过70 μm细胞筛过滤，获得单细胞悬液；4℃下1500 rpm离心5 min，收集细胞沉淀。
（4）基质胶包埋与接种：将细胞沉淀与冷的BME凝胶混合，以25 μL液滴形式接种于孔板中，待基质胶固化后，加入起始培养基（Adv DMEM/F-12培养基，含EGF、FGF、HGF、R-spondin、A83-01、Noggin、Wnt、Y27632、hES克隆恢复补充物等添加物）。
（5）ICO培养：3天后更换为扩增培养基，去除Noggin、Wnt、Y27632、hES克隆恢复补充物；每2-3天换液一次，并每7天以1:3的比例传代。
（6）ICO鉴定：类器官形态上可见具有腔体的囊状结构，通过免疫荧光可观察到胆管标志物KRT19的表达。
图4. IHBD来源的ICO鉴定[3,4]
2.1.2 hiPSC来源的ICO建立过程[5]
第一阶段：hiPSC培养与肝母细胞分化
此阶段目标是将多能干细胞定向分化为肝母细胞。
（1）hiPSC培养：将状态良好的hiPSC以单细胞悬液接种在明胶包被的培养板上。
（2）内胚层诱导与肝向定型：
第0天：使用含CHIR99021（Wnt通路激活剂）的RPMI/B27培养基处理24小时，启动分化。
第1-4天：更换为含Activin A和LY294002的RPMI/B27培养基，诱导细胞向内胚层命运转化。
第5-7天：添加 FGF2 和 BMP4，共同驱动细胞向肝向定型。
第8-9天：使用无甲硫氨酸的RPMI/B27培养基，可选择性去除未分化细胞；并添加FGF4、HGF、EGF和视黄酸。
第10天：获得可分化为肝细胞或胆管细胞的肝母细胞。
第二阶段：肝母细胞向胆管细胞分化
此阶段目标是在2D条件下将肝母细胞诱导为胆管细胞。
（1）铺板：在上述的第10天，用细胞解离缓冲液（CDB）将肝母细胞消化下来，以约7×105 cells/mL的密度接种到胶原蛋白I包被的板上，培养4小时使其贴壁。
（2）胆管细胞分化与成熟：
第10天：贴壁后，更换为胆管分化培养基（BDM）。
第11-13天：在BDM中添加人生长激素、EGF、维生素C。
第14-18天：在BDM中添加IL-6、维生素C。
第三阶段：3D胆管细胞类器官的形成
此阶段目标是将二维胆管细胞转化为具有功能的3D类器官。
第19天：用CDB消化胆管细胞。注意不要完全吹打成单细胞，而是保留细胞团块。将细胞团块重悬于1:1预冷的BDM/Matrigel混合液中，补充EG、Y27632、维生素C。随后将100 μL混合物种在预热的培养板中，凝固后加入含细胞因子的BDM培养基。
第20-45天：每两天更换一次含IL-6、维生素C、EGF的BDM培养基。
在此期间，类器官逐渐形成囊泡或分支管状结构。
hiPSC来源的ICO鉴定[5]
（1）形态学观察：在显微镜下可观察到具有中央腔隙的囊泡或分支管状结构。
图5. hiPSC形成胆管细胞类器官[5]
（2）标志物检测：采用免疫荧光染色观察，可见KRT7、ASBT等胆管特异性蛋白表达，βCAT与F-Actin（Phall）的细胞极性分布，以及乙酰化α-tubulin标记的初级纤毛。
图6. ICO标志物表达[5]
2.2 分支胆管细胞类器官（BRCO）
2.2.1 建立过程[6]：
图7. BRCO的培养示意图[6]
第一阶段：ICO的建立与扩增
（1）样本来源：成人肝内胆管组织，通常在活检组织中获取。
（2）组织处理：将组织用胶原酶消化，加入含双抗等添加物、预冷的Adv DMEM/F12培养基，4℃下453g离心5 min；随后将细胞悬液经70 μm尼龙细胞筛过滤，再以相同的条件离心，弃上清。
（3）初始培养：将细胞沉淀与BME凝胶混合，形成圆顶结构；使用标准类器官扩增培养基进行培养，其关键成分包括WNT信号激动剂、RSPO1（放大WNT信号）、Noggin、生长因子（EGF、FGF10、HGF）、A83-01（TGF-β信号抑制剂）等。
（4）培养与传代：类器官会逐渐形成囊状结构，随后定期使用胰蛋白酶进行消化传代，一扩增细胞数量，并确保至少连续传代3次。
第二阶段：BRCO的诱导
通过改变细胞微环境，将其从增殖状态诱导至具有分支管状结构的状态。
（5）切换培养基：将传代3次以上的ICO从扩增培养基切换至分支诱导培养基。分支诱导培养基的关键成分与变化，包括使用William’s E基础培养基、RSPO1（激活非经典WNT信号）、DKK1（抑制经典的WNT信号）、生长因子仅保留EGF，以及地塞米松和抗坏血酸钠盐等添加剂。
（6）形态转变：在转换培养基后的几天至两周内，原本的囊状类器官开始伸出芽孢，并逐渐延伸、分支，形成复杂的3D分支管状网络。
（7）长期培养：一旦BRCOs形成，可通过机械分离进行长期传代，一般可以扩增超过20代，并能稳定维持其分支结构。
2.2.2 BRCO鉴定与特征指标
（1）形态结构
方法：普通光学显微镜、透射电镜、共聚焦显微镜。
形态特征：可观察到3D分支管状结构，而非简单的囊泡。电镜下可见微绒毛和紧密连接等关键上皮结构，共聚焦成像证实其具备连续开放的管腔。
图8. 普通显微镜、TEM、共聚焦观察BRCO形态[6]
（2）细胞标志物鉴定
方法：免疫荧光染色等。
l 指标特点：表达胆管核心标志物KRT19/KRT7。关键功能蛋白呈现典型极性分布：ZO-1与CFTR位于管腔膜，而分泌素受体位于基底侧膜，与原位胆管细胞一致。
图9. BRCO标志物的极性分布[6]
（3）生理功能鉴定
方法：罗丹明123转运检测、激素刺激肿胀实验、尤斯灌流室测量。
鉴定指标：具备MDR1介导的主动转运功能。对分泌素刺激产生管腔肿胀反应，证实CFTR介导的离子/水转运功能。电生理测量直接记录到CFTR与ANO1离子通道的活性。
图10. BRCO生理功能鉴定[6]
以上便是关于胆管细胞类器官的介绍，以及ICO和BRCO的建立方法和鉴定，下期我们将继续整理介绍肝外胆管细胞类器官的内容，欢迎大家持续关注小恒学术~
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参考文献
[1] Babboni S, Vacca PG, Simonini L, Pezzati D, Martinelli C, Frongillo F, Bianco G, Marciano E, Basta G, Ghinolfi D, Del Turco S. Cholangiocyte Organoids: The New Frontier in Regenerative Medicine for the Study and Treatment of Cholangiopathies. J Clin Med. 2024 Mar 21;13(6):1804. doi: 10.3390/jcm13061804. PMID: 38542027; PMCID: PMC10970730.
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